La peinture des Pays-Bas du XVIe siècle est aussi riche que variée. Plusieurs tendances s'affirment et de nouveaux genres apparaissent. Les collections exceptionnelles du musée rendent compte de ces différents courants, tout comme de l'originalité des artistes qui les forment.

Le parcours s'ouvre avec les écoles brugeoise et anversoise du début du siècle, représentées par des œuvres clés de Gerard David, Quinten Metsys et Joos van Cleve. Viennent ensuite les maniéristes anversois, puis les romanistes, Jan Gossaert - qui fut le premier artiste à peindre des nus mythologiques aux Pays-Bas, comme en témoigne Vénus et l'Amour - et Bernard van Orley, dont le Triptyque de la vertu de Patience, réalisé pour la régente Marguerite d'Autriche, est l'un de ses chefs-d'œuvre. Le début du paysage indépendant est marqué par des réalisations de Joachim Patenier et Herri met de Bles. Jan van Hemessen, Pieter Aertsen, Joachim Beuckelaer et son frère présumé Huybrecht Beuckeleer illustrent l'essor de la peinture de « genre ».

La section comprend également un important ensemble de tableaux de Pierre Bruegel l'Ancien, parmi lesquels le célèbre Dénombrement de Bethléem. D'autres créations du maître sont encore représentées par des copies de son fils, Pierre le Jeune, dont l'imposantCombat de Carnaval et Carême,acquis en 1999. Parmi les peintures italiennes du XVIe siècle, le musée conserve quelques beaux Tintoret, tandis que Lucas Cranach l'Ancien et Conrad Faber évoquent les caractéristiques de l'école allemande.